Minitransposón artificial para crear biblioteca de expresión de mutación en proteínas

Un nuevo método eficaz para la producción de bibliotecas de la expresión de proteínas mutadas ofrece beneficios únicos para los estudios de estructura y función de las proteínas y la ingeniería de proteínas.

El minitransposón fue diseñado y utilizado específicamente, por inserción aleatoria mediante la enzima MuA transposasa, para crear una biblioteca de genes para expresar un conjunto de mutantes de proteínas que proporciona una diversidad de secuencias únicas de proteína con respecto a los métodos existentes.

Las bibliotecas que expresen mutantes múltiples de una proteína dada son particularmente útiles para estudiar mecanismos de proteínas y la adaptación de las proteínas durante la evolución molecular, así como para el diseño de proteínas (tales como biosensores e interruptores moleculares) con nuevas funciones en biología sintética, incluidas posibles enzimas para farmacoterapia.

Un tipo de biblioteca en uso se compone de mutantes de proteínas “mutadas circularmente”, proteínas que han sido mutadas mediante la conexión de los dos extremos (N- y C-terminal) y después rotas en otras partes, obteniendo a menudo también una(s) parte(s) alterada(s) en el medio.

El nuevo método, llamado PERmutación con Ingeniería de Transposasa (PERMUTE), para hacer este tipo de biblioteca, fue desarrollado por el estudiante de pregrado Manan Mehta y su mentor, Jonathan Silberg, profesor asistente en el Departamento de Bioquímica y Biología Celular de la Universidad Rice (Houston, TX, EUA), con la asistencia de la técnica de investigación y coautora, Shirley Liu.

“La creación de una biblioteca, como ésta, ha requerido tradicionalmente de cuidadosos procesos” dijo el profesor Silberg. “Los métodos existentes para reordenar los bits de información de una proteína son lentos y difíciles de usar”, dijo. “Además, no son ideales, ya que crean simultáneamente varios tipos de mutaciones, los reordenamientos deseados y las eliminaciones no deseadas de aminoácidos importantes”.

El profesor Silberg además explicó: “Con nuestro método, sólo se generan mutantes con secuencias reorganizadas y no es necesario ser experto en ingeniería biomolecular. Todo lo que se necesita es el ADN que codifica el gen de interés, el minitransposón artificial que diseñamos y una enzima. [...] Es una manera de hacer, con gran control, toda la diversidad de este tipo de mutaciones que podría existir en una proteína”.

En este estudio, publicado en línea antes de su impresión el 7 de febrero de 2012, en la revista Nucleic Acids Research, se creó una biblioteca donde se mutó la enzima adenilato quinasa. La biblioteca de proteínas mutantes fue entonces examinada para hallar variantes que retuvieran su función catalítica introduciéndolas en la bacteria Escherichia coli para su posterior cribado y selección según su actividad como adenilato quinasa. De alrededor de 220 mutantes secuenciadas (aproximadamente la mitad de las cuales eran activas), se identificaron 15 variantes de secuencias únicas.

El trabajo fue financiado por la Administración Nacional de Aeronáutica y del Espacio (NASA, EUA) y la Fundación Robert A. Welch (The Welch Foundation, Houston, TX, EUArg).

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Rice University